細胞色素C 是以一種鐵卟啉為輔基的呼吸酶，廣泛存在于所有的需氧組織中。在心肌與其他做劇烈運動的肌肉中含量zui為豐富。細胞色素C 位于線粒體的蛋白質—脂質絡合物中，分子量約為13000，肽鏈中含有19個賴氨酸殘基，為一堿性蛋白, 等電點（10.5~10.8）高、易溶于酸性溶液, 故采用酸化水提取。人造沸石為鋁酸鈉，它是一種陽離子交換劑，細胞色素C 分子剛好進入它的表面空隙。在pH7.5時細胞色素C 呈正電荷，它可與沸石分子上的鈉離子發(fā)生交換，從而被沸石吸附。裝入層析柱后，用25%硫酸銨洗脫，又可將細胞色素C 交換下來。硫酸銨主要是降低沸石對細胞色素C 的親和力。硫酸銨鹽析可明顯提高細胞色素C 純度，主要為去除雜蛋白。另外三氯乙酸可引起細胞色素C 變性和聚合，必須嚴格控制三氯乙酸用量。
細胞色素C與材料試劑
1、 設備：組織搗碎機、酸度計、離心機、分光光度計、層析柱、透析袋、磁力攪拌器、冰箱。
2、 儀器：剪刀、燒杯、漏斗、濾紙、天平、玻璃棒、紗布、試管、膠頭滴管。
3、 試劑：聯(lián)二亞硫酸鈉、硫酸、硫酸銨、三氯乙酸、人造沸石、氯化鋇、氯化鈉、氫氧化銨。
4、 材料：新鮮豬心（2個）。
細胞色素C實驗步驟
1、預處理：健康豬心去脂肪等結締組織—→剪碎放入碎冰中（保護酶的活性，避免搗碎機破碎時使酶失活）—→放入生理鹽水中清洗去污—→稱重：燒杯80g ，燒杯＋豬心=240g，（240-80）×1.5=240ml酸化水—→組織搗碎機勻漿10min （勻漿3min ，停5min ，為了保證搗碎機安全）
2、提取：攪拌后靜置2h —→四層紗布過濾后加入1.5倍酸化水于沉淀物中，在過濾后靜置2h —→放入冰箱保存過夜—→從冰箱中取出—→加2mol/L氨水調PH 至6.0，靜置30min ，過濾—→濾液加2mol/L氨水調PH 至7.5，靜置30min, 過濾
3、吸附：加10%人造沸石（濾液為220ml ）—→磁力攪拌器攪拌吸附1h —→蒸餾水洗3次—→0.2%NaCI 溶液洗3次—→濾出人造沸石待用
4、洗脫：在柱中裝人造沸石體積的三分之二蒸餾水—→將沸石放入柱中—→裝滿25%硫酸銨溶液進行洗脫，流速控制在2ml/min 以下, 收集紅色的洗脫液（沒分辨出紅色液體階段，收集了所有洗脫液）
5、鹽析：在洗脫液（300ml ）中慢慢加入固體硫酸銨75g, 邊加邊攪拌，使硫酸銨溶液的濃度為50%—→置4℃冰箱過夜—→過濾，收集濾液—→向過濾液中按22ml/L的量滴加濃度為20%的三氯乙酸溶液（過濾液和20%三氯乙酸溶液在4℃遇冷, 邊加邊攪拌, 加時要快, 防止局部蛋白質變性）—→加完后分成8管，立即離心—→無明顯沉淀，再5000轉離心15min —→無明顯沉淀，向每只離心管加入2滴濃度為20%的三氯乙酸溶液—→再5000轉離心15min —→無明顯沉淀，實驗結束
6、透析 將上述溶解后的細胞色素C 裝入透析袋中, 放進500ml 燒杯中（用磁力攪拌器攪拌），用去離子水透析, 除去硫酸根離子，15min 換水一次，換手3~4次后，檢查硫酸根離子是否已被除盡。檢查方法：取2ml 氯化鋇溶液加入試管中，滴加2~3滴透析外液至試管中，若出現(xiàn)白色沉淀，表示硫酸根離子未除盡，如果不出現(xiàn)沉淀，表示透析*。將透析液過濾， 收集濾液即為細胞色素C 粗品。 記錄此粗品的體積。
掃一掃，關注微信
當前位置：